自(zì)2020年(nián)10月上海快(kuài)靈發布“非洲豬瘟高敏PCR試劑盒”（下稱高敏試劑盒）以來(lái)，其出色的靈敏度、敏感性、特異性及穩定性迅速被廣大(dà)豬場實驗室認可(kě)。随着熒光(guāng)PCR相(xiàng)關技術(shù)的普及以及用戶群體(tǐ)的增大(dà)，部分(fēn)之前未被重視的問(wèn)題也逐漸顯露出來(lái)。本篇我們探討(tǎo)下各廠(chǎng)家都(dōu)諱莫如(rú)深的一個點——“假陽”問(wèn)題，以及相(xiàng)應的解決方案。

“假陽”問(wèn)題，事(shì)實上在熒光(guāng)PCR領域并不少見(jiàn)，而造成假陽産生(shēng)的原因也是紛繁複雜：如(rú)操作(zuò)不當污染、環境氣溶膠污染或者試劑生(shēng)産過程污染等。本文所要探討(tǎo)的“假陽”，主要指因試劑特異性導緻的假陽，換句話(huà)說(shuō)，即文中所提的“假陽”，與操作(zuò)者、儀器、環境均無關，隻與試劑盒内的試劑有關。那麽試劑盒中到底什麽與“假陽”相(xiàng)關呢(ne)？縱觀商業化的非瘟病毒PCR檢測試劑盒，其中都(dōu)會提及一個重要參數——特異性。

何爲特異性呢(ne)？在PCR擴增過程中，如(rú)果我們要擴增的非洲豬瘟DNA片段在整條DNA鏈上不止出現了一次，或者樣品中混有的其他(tā)物種、細胞或病毒的DNA中含有類似的DNA片段，則可(kě)能會将其他(tā)片段擴增出來(lái)，那最後儀器顯示出來(lái)的陽性結果就(jiù)不一定是非瘟病毒DNA造成的，于是陽性結果也就(jiù)變成了假陽。因此，通俗來(lái)說(shuō)，特異性反應的是試劑盒能擴增出特定DNA片段的性能，特異性越低，則試劑盒擴增其他(tā)片段的概率就(jiù)越大(dà)，即“假陽”幾率更大(dà)。
   市售的衆多非瘟病毒PCR檢測試劑盒中，絕大(dà)多數廠(chǎng)商在宣傳其試劑盒特異性時均會标注＞99%，最低也不會低于98%，快(kuài)靈的高敏試劑盒也是如(rú)此，特異性可(kě)達到99.9%，屬實是已經做到了極限，即使PCR技術(shù)發展至今，因爲模闆DNA的不确定，依然無法保證100%的特異性。也正因此，特異性，也就(jiù)是假陽的問(wèn)題是被大(dà)家忽視了。

在服務客戶的過程中，我們發現很多客戶在進行非瘟病毒檢測遇到極弱樣本或疑似樣本時，對于陽性場，往往遵循的是“甯殺錯，不放(fàng)過”，而對于陰性場，往往帶來(lái)心理(lǐ)的恐慌，需要确認到底是不是陽性。的确，随着非瘟一波波的襲來(lái)，各檢測單位的工(gōng)作(zuò)量都(dōu)史無前例的倍增，再重新來(lái)一遍的全面複核，顯然是對人(rén)力和成本的巨大(dà)考驗。面對這樣的大(dà)環境，快(kuài)靈人(rén)陷入了沉思。

“我們爲什麽要甯殺錯？”

“當真沒有辦法消除假陽麽？”

帶着這樣的問(wèn)題，我們開始了新的一輪又一輪的嘗試：提升試劑盒的靈敏度、将特異性由99%提升至99.9%……或許，我們可(kě)以把眼界放(fàng)寬，不局限于單純的擴增？

于是，高敏試劑盒上市半年(nián)後，我們在高敏試劑盒基礎之上研發出其“升級版”——快(kuài)靈高敏試劑盒（熔解确認版）。

快(kuài)靈高敏試劑盒（熔解确認版），其性能參數與高敏試劑盒一緻，我們同樣保證其靈敏度、敏感性、穩定性、特異性處在行業頂尖水平，确保客戶可(kě)以第一時間檢測出陽性樣本。包括其操作(zuò)、擴增階段也與高敏試劑盒别無二緻，至此，我們可(kě)以把快(kuài)靈高敏試劑盒（熔解确認版）等同于高敏試劑盒。詳見(jiàn)表1：

表1：高敏試劑盒與假陽确認試劑盒基本性能參數對比

但(dàn)，重點來(lái)了！快(kuài)靈是怎麽做到的？快(kuài)靈高敏試劑盒（熔解确認版）突破性地使用了一個新的反應程序——熔解曲線。熔解曲線能鑒别不同的DNA片段，依靠的不是Ct.值，而是其特有的熔解峰，即Tm值，即使一個DNA片段中僅相(xiàng)差一個堿基，都(dōu)能導緻Tm值變動。依靠Tm值的判定就(jiù)可(kě)以确認之前擴增陽性的非瘟樣本是否爲真的非瘟陽性，以此達到鑒别假陽，消除客戶疑慮的目的。

圖1：擴增曲線Ct.值判讀(dú)陰陽        圖2：熔解曲線檢測疑似/弱陽樣本，排除假陽

非瘟新形勢下，除了要求試劑盒更早的檢測出陽性，更需要真正“精準”檢測。快(kuài)靈高敏試劑盒（熔解确認版）除了超高的靈敏度、特異性，更是“自(zì)帶”熔解曲線，讓假陽無處可(kě)藏，讓弱陽“站(zhàn)得(de)住腳”，真正做到打消客戶疑慮，真正做到“不殺錯、不放(fàng)過”。